خطاهای رایج در کروماتوگرافی HbA1c
خلاصه:* روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) به عنوان یکی از دقیقترین روشهای اندازهگیری HbA1c شناخته میشود، اما با این حال مستعد خطاهای متعددی است. این مقاله به بررسی جامع خطاهای رایج شامل تداخل با واریانتهای هموگلوبین، وجود هموگلوبین ناپایدار (LHbA1c)، و تأثیر مواد درونزا و برونزا میپردازد.
۱. مقدمه
اندازهگیری دقیق HbA1c برای تشخیص و مدیریت دیابت حیاتی است. روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) به دلیل دقت بالا و قابلیت جداسازی انواع مختلف هموگلوبین، به عنوان روش مرجع در بسیاری از آزمایشگاهها استفاده میشود. با این حال، این روش نیز مانند هر تکنیک آزمایشگاهی دیگری، در معرض خطاها و تداخلاتی است که میتوانند منجر به نتایج کاذب و تصمیمگیریهای درمانی اشتباه شوند. مهمترین پیامد این خطاها، خطر درمان بیش از حد یا ناکافی دیابت است که میتواند عواقب جدی برای بیمار داشته باشد.
۲. واریانتهای هموگلوبین (هموگلوبینوپاتیها)
بیش از ۱۱۰۰ نوع واریانت هموگلوبین در سراسر جهان شناسایی شده است و حدود ۷٪ از جمعیت جهان دارای نوعی واریانت هتروزیگوت هستند که اغلب از نظر بالینی خاموش است. این واریانتها میتوانند به طرق مختلف با اندازهگیری HbA1c تداخل ایجاد کنند:
۲.۱. تداخل در جداسازی کروماتوگرافی
هنگامی که یک واریانت هموگلوبین در کروماتوگرام با پیک HbA1c همپوشانی پیدا کند، نتیجه اندازهگیری به طور کاذب افزایش یا کاهش مییابد.
مثالهای عینی:
- Hb Phnom Penh: در یک بیمار دیابتی، وجود این واریانت نادر α-گلوبین باعث شد سطح HbA1c با روش HPLC به میزان ۸.۷٪ گزارش شود، در حالی که روش کروماتوگرافی تمایلی (Boronate Affinity) سطح ۶.۲٪ را نشان داد که با قند خون ناشتای بیمار (۱۳۳-۱۰۰ mg/dL) همخوانی بیشتری داشت. این اختلاف قابل توجه میتوانست منجر به تشدید درمان و افزایش خطر هیپوگلیسمی شود.
- HbD Punjab: در یک بیمار هموزیگوت با واریانت HbD، دستگاه HPLC نتیجه HbA1c را ۳.۸٪ گزارش کرد در حالی که مقدار واقعی ۵.۲٪ بود.
- واریانتهای نادر با الگوی “Doublet”: در برخی موارد نادر (حدود ۱ در ۳۰,۰۰۰ نمونه)، واریانتهای نادری مانند Hb Hofu، Hb Tyne، Hb Athens-GA و Hb Tacoma باعث ایجاد الگوی پیک دوگانه (Doublet) در کروماتوگرام میشوند که توسط نرمافزار دستگاه علامتگذاری میشود و از محاسبه دقیق جلوگیری میکند. نکته مهم این است که برخی از این واریانتها (مانند Hb Tyne) ممکن است در روشهای غربالگری روتین مانند الکتروفورز مویرگی قابل شناسایی نباشند.
۲.۲. تأثیر واریانتهای شایع
واریانتهای شایعتر مانند HbS، HbE، HbC و HbD نیز میتوانند تداخل ایجاد کنند:
- HbE: ممکن است باعث افزایش کاذب یا ایجاد پرچم هشدار در دستگاه شود.
- HbD: بسته به نوع و روش اندازهگیری، میتواند باعث کاهش یا افزایش کاذب نتایج شود.
۳. هموگلوبین ناپایدار (Labile HbA1c – LHbA1c)
هموگلوبین ناپایدار یا LHbA1c، یک واسطه برگشتپذیر در فرآیند گلیکاسیون است که در غلظتهای بالای گلوکز خون به سرعت تشکیل میشود. این ماده میتواند تداخل جدی در روش HPLC ایجاد کند:
مورد بالینی قابل توجه: در یک بیمار مبتلا به دیابت نوع ۱ برقآسا (Fulminant Type 1 DM) با قند خون ۱۴۶۴ mg/dL، دستگاه HPLC قادر به اندازهگیری HbA1c نبود. روز بعد با کاهش قند خون به ۲۱۲ mg/dL، همان روش مقدار ۷.۱٪ را گزارش کرد. این نشان میدهد که وجود LHbA1c در شرایط هیپرگلیسمی شدید، مانع از اندازهگیری دقیق شده است.
۴. مواد مداخلهگر درونزا و برونزا
یک مطالعه جامع بر روی تداخلات روش HPLC نشان داد که برخی مواد درونزا و برونزا میتوانند نتایج HbA1c را تغییر دهند:
- مواد درونزا: اسید صفراوی (Bile Acid) و pH پایین خون میتوانند باعث افزایش کاذب HbA1c شوند.
- مواد برونزا: اتانول (الکل) در غلظتهای بالا، نتایج را در نمونههای با HbA1c پایین افزایش و در نمونههای با HbA1c بالا کاهش میدهد.
اگرچه آستانه غلظت این مواد مداخلهگر در دستگاههای مختلف اندکی متفاوت است، اما آگاهی از این تداخلات برای تفسیر صحیح نتایج ضروری است.
۵. رویکرد تشخیصی و راهکارهای عملی
برای شناسایی و مدیریت خطاهای کروماتوگرافی، رعایت نکات زیر توصیه میشود:
۱. بررسی دقیق کروماتوگرام: بازرسهای دقیق کروماتوگرام میتوانند وجود پیکهای غیرطبیعی یا الگوهای مشکوک (مانند Doublet) را آشکار کنند که ممکن است نشاندهنده وجود واریانت هموگلوبین باشد.
۲. استفاده از روشهای جایگزین: در صورت مشکوک بودن به تداخل، استفاده از روشهای مبتنی بر اصول متفاوت توصیه میشود:
- کروماتوگرافی تمایلی (Boronate Affinity): این روش بر اساس ساختار مولکولی عمل میکند و کمترین تداخل را با واریانتهای هموگلوبین دارد.
- تست فروکتوزامین: این تست گلیکاسیون پروتئینهای سرم را اندازهگیری میکند و تحت تأثیر واریانتهای هموگلوبین قرار نمیگیرد، هرچند میانگین قند خون کوتاهمدتتر (۲-۳ هفته) را نشان میدهد.
۳. مشورت با آزمایشگاه بالینی: در صورت وجود هرگونه عدم تطابق بین نتیجه HbA1c و وضعیت بالینی بیمار (مانند قند خون ناشتا یا نتایج پایش مداوم قند خون)، مشورت با متخصصان آزمایشگاه برای بررسی روش مورد استفاده و تداخلات احتمالی ضروری است.
۴. توجه به سابقه بیمار: آگاهی از نژاد و سابقه فامیلی بیمار (به ویژه نژادهای آفریقایی، مدیترانهای و آسیایی که شیوع واریانتها در آنها بیشتر است) میتواند به شناسایی زودهنگام تداخلات کمک کند.
